Современная биология и нейронаука остро нуждаются в точных методах профилирования белковой экспрессии для глубокого понимания функций клеток и их реакций на различные условия, включая болезни и терапевтические воздействия. Однако традиционные методы микроскопии и маркировки сталкиваются с серьезными ограничениями при исследовании миллионов плотно упакованных клеток в цельных трехмерных тканях, таких как мозг мыши или регионы человеческого мозга. Классические подходы часто ограничиваются тонкими срезами ткани из-за проблем с проникновением света и химических веществ, что затрудняет изучение белковой экспрессии в целостных, взаимосвязанных системах.
Чтобы преодолеть эти препятствия, группа ученых из Массачусетского технологического института (MIT) разработала принципиально новую технологию под названием CuRVE (Continuously Uniform and Rapid Volumetric processing of large tissues for immunostaining and CUBIC-based imaging), реализованную в виде eFLASH (electrophoretic Flow-enhanced FLASH). Этот инновационный метод обеспечивает быструю, равномерную и универсальную маркировку белков миллионов отдельных клеток в интактных трехмерных тканях. Используя eFLASH, исследователи смогли качественно маркировать целые мозг грызунов и другие крупные образцы тканей всего за один день.
Результаты исследования, опубликованного в журнале Nature Biotechnology, наглядно демонстрируют превосходство eFLASH над широко используемыми традиционными методами маркировки и раскрывают новые перспективы, которые ранее оставались незамеченными. eFLASH позволяет проводить маркировку белков антителами на уровне отдельных клеток по всему объему мозга, предоставляя беспрецедентный уровень детализации и масштаба в исследованиях клеточной организации.
По словам старшего автора исследования, профессора MIT Квангхуна Чунга, общепринятые методы требуют диссоциации или нарезки тканей, поскольку «свет и химические вещества, необходимые для анализа, не могут глубоко проникать в ткани». Лаборатория профессора Чунга, представляющая Институт Пиковера по изучению памяти и обучения, факультеты химической инженерии и когнитивных наук и мозга, а также Институт медицинских инженерии и науки при MIT, ранее разработала такие технологии, как CLARITY и SHIELD, для придания органам прозрачности, облегчая их исследование.
Проблема равномерной обработки тканей аналогична маринованию толстого куска мяса: внешние слои быстро впитывают маринад, в то время как внутренние слои остаются нетронутыми, если только мясо не вымачивается в течение длительного времени. Маркировка белков является еще более сложной задачей, поскольку молекулы для маркировки – антитела – в сотни раз крупнее компонентов маринада. Это приводит к крайне медленной диффузии и делает равномерную обработку тканей размером с орган практически невозможной и чрезвычайно длительной, занимая недели.
Технология CuRVE и ее реализация eFLASH обходят эти технические барьеры, предлагая принципиально новый подход к равномерной обработке крупных и плотных тканей целиком. eFLASH, являясь реализацией CuRVE, устраняет несоответствие между медленным проникновением антител и быстрым связыванием антител в тканях. Стратегия eFLASH заключается в непрерывном контроле скорости связывания антител, одновременно ускоряя их проникновение.
В основе eFLASH лежит предыдущая разработка лаборатории Чунга – технология SWITCH, которая временно отключала связывание антител, чтобы обеспечить их проникновение. В отличие от SWITCH, где использовались жесткие химические вещества, непригодные для длительной обработки, eFLASH обеспечивает непрерывный контроль скорости связывания антител. В результате скрининга химических веществ была обнаружена дезоксихолевая кислота, идеально подходящая для тонкой и непрерывной регулировки скорости связывания антител. Контроль осуществляется путем изменения концентрации дезоксихолевой кислоты и pH (кислотности) маркировочной ванны.
Для ускорения проникновения антител eFLASH использует стохастический электротранспорт – еще одну технологию, изобретенную в лаборатории Чунга. Применение электрических полей ускоряет дисперсию антител через ткань. Таким образом, система eFLASH объединяет ускоренную дисперсию и непрерывно регулируемую скорость связывания.
Исследователи использовали более 60 различных антител для маркировки белков в разнообразных образцах, включая целые мозг мышей и крыс, целые эмбрионы мышей, целые органы мышей (легкие, сердце) и блоки мозговой ткани более крупных животных, включая человека. Каждый образец был промаркирован в течение дня, что считается «сверхбыстрым» для цельных, интактных органов. При этом различные препараты не требовали новых этапов оптимизации, что подчеркивает надежность и универсальность технологии.
Для валидации eFLASH маркировка антителами была сопоставлена с генетическим методом маркировки, при котором клетки генетически модифицируются для флуоресценции при транскрипции гена интересующего белка. Генетический метод имеет преимущество, заключающееся в отсутствии необходимости распространения антител по ткани, но он также подвержен неточностям, поскольку отчет о транскрипции гена и фактическое производство белка не всегда совпадают. Соведущий автор исследования, старший инженер по применению в компании LifeCanvas Technologies (стартап, основанный Чунгом), Дэй Хи Юн, отметил, что маркировка антителами «надежно и немедленно сообщает о наличии целевого белка», в то время как генетические методы могут быть менее оперативными и устойчивыми, флуоресцируя даже после исчезновения белка.
При одновременном использовании eFLASH (антительная маркировка) и генетической маркировки в образцах исследователи обнаружили многочисленные расхождения между этими двумя методами. Например, в некоторых областях мозга мыши антительная маркировка показала экспрессию белка PV (парвальбумина, белка в тормозных нейронах) в двух третях нейронов, в то время как генетическая маркировка не выявила генетически обусловленной флуоресценции в этих нейронах. В другом случае генетическая маркировка сообщала об экспрессии белка ChAT (холин-ацетилтрансферазы), но антительная маркировка подтвердила это лишь в незначительной доле клеток. Эти результаты указывают на то, что генетическая маркировка может как занижать, так и завышать уровень экспрессии белка по сравнению с маркировкой антителами.
Таким образом, исследователи подчеркивают, что eFLASH и маркировка антителами в масштабе всего органа могут предоставить более богатый и полный контекст для данных, полученных генетическими методами. Открытие «значительной региональной потери PV-иммунореактивных нейронов у здоровых взрослых мышей и высокой индивидуальной изменчивости» подчеркивает важность целостного и непредвзятого фенотипирования, обеспечиваемого eFLASH. Как отметил Дэй Хи Юн, это «два разных инструмента для выполнения одной и той же работы», подчеркивая взаимодополняющий характер антительной и генетической маркировки. Соведущим автором исследования также является Ён-Гюн Пак, в настоящее время доцент KAIST в Южной Корее, ранее работавший постдоком в MIT.
Изображение носит иллюстративный характер
Чтобы преодолеть эти препятствия, группа ученых из Массачусетского технологического института (MIT) разработала принципиально новую технологию под названием CuRVE (Continuously Uniform and Rapid Volumetric processing of large tissues for immunostaining and CUBIC-based imaging), реализованную в виде eFLASH (electrophoretic Flow-enhanced FLASH). Этот инновационный метод обеспечивает быструю, равномерную и универсальную маркировку белков миллионов отдельных клеток в интактных трехмерных тканях. Используя eFLASH, исследователи смогли качественно маркировать целые мозг грызунов и другие крупные образцы тканей всего за один день.
Результаты исследования, опубликованного в журнале Nature Biotechnology, наглядно демонстрируют превосходство eFLASH над широко используемыми традиционными методами маркировки и раскрывают новые перспективы, которые ранее оставались незамеченными. eFLASH позволяет проводить маркировку белков антителами на уровне отдельных клеток по всему объему мозга, предоставляя беспрецедентный уровень детализации и масштаба в исследованиях клеточной организации.
По словам старшего автора исследования, профессора MIT Квангхуна Чунга, общепринятые методы требуют диссоциации или нарезки тканей, поскольку «свет и химические вещества, необходимые для анализа, не могут глубоко проникать в ткани». Лаборатория профессора Чунга, представляющая Институт Пиковера по изучению памяти и обучения, факультеты химической инженерии и когнитивных наук и мозга, а также Институт медицинских инженерии и науки при MIT, ранее разработала такие технологии, как CLARITY и SHIELD, для придания органам прозрачности, облегчая их исследование.
Проблема равномерной обработки тканей аналогична маринованию толстого куска мяса: внешние слои быстро впитывают маринад, в то время как внутренние слои остаются нетронутыми, если только мясо не вымачивается в течение длительного времени. Маркировка белков является еще более сложной задачей, поскольку молекулы для маркировки – антитела – в сотни раз крупнее компонентов маринада. Это приводит к крайне медленной диффузии и делает равномерную обработку тканей размером с орган практически невозможной и чрезвычайно длительной, занимая недели.
Технология CuRVE и ее реализация eFLASH обходят эти технические барьеры, предлагая принципиально новый подход к равномерной обработке крупных и плотных тканей целиком. eFLASH, являясь реализацией CuRVE, устраняет несоответствие между медленным проникновением антител и быстрым связыванием антител в тканях. Стратегия eFLASH заключается в непрерывном контроле скорости связывания антител, одновременно ускоряя их проникновение.
В основе eFLASH лежит предыдущая разработка лаборатории Чунга – технология SWITCH, которая временно отключала связывание антител, чтобы обеспечить их проникновение. В отличие от SWITCH, где использовались жесткие химические вещества, непригодные для длительной обработки, eFLASH обеспечивает непрерывный контроль скорости связывания антител. В результате скрининга химических веществ была обнаружена дезоксихолевая кислота, идеально подходящая для тонкой и непрерывной регулировки скорости связывания антител. Контроль осуществляется путем изменения концентрации дезоксихолевой кислоты и pH (кислотности) маркировочной ванны.
Для ускорения проникновения антител eFLASH использует стохастический электротранспорт – еще одну технологию, изобретенную в лаборатории Чунга. Применение электрических полей ускоряет дисперсию антител через ткань. Таким образом, система eFLASH объединяет ускоренную дисперсию и непрерывно регулируемую скорость связывания.
Исследователи использовали более 60 различных антител для маркировки белков в разнообразных образцах, включая целые мозг мышей и крыс, целые эмбрионы мышей, целые органы мышей (легкие, сердце) и блоки мозговой ткани более крупных животных, включая человека. Каждый образец был промаркирован в течение дня, что считается «сверхбыстрым» для цельных, интактных органов. При этом различные препараты не требовали новых этапов оптимизации, что подчеркивает надежность и универсальность технологии.
Для валидации eFLASH маркировка антителами была сопоставлена с генетическим методом маркировки, при котором клетки генетически модифицируются для флуоресценции при транскрипции гена интересующего белка. Генетический метод имеет преимущество, заключающееся в отсутствии необходимости распространения антител по ткани, но он также подвержен неточностям, поскольку отчет о транскрипции гена и фактическое производство белка не всегда совпадают. Соведущий автор исследования, старший инженер по применению в компании LifeCanvas Technologies (стартап, основанный Чунгом), Дэй Хи Юн, отметил, что маркировка антителами «надежно и немедленно сообщает о наличии целевого белка», в то время как генетические методы могут быть менее оперативными и устойчивыми, флуоресцируя даже после исчезновения белка.
При одновременном использовании eFLASH (антительная маркировка) и генетической маркировки в образцах исследователи обнаружили многочисленные расхождения между этими двумя методами. Например, в некоторых областях мозга мыши антительная маркировка показала экспрессию белка PV (парвальбумина, белка в тормозных нейронах) в двух третях нейронов, в то время как генетическая маркировка не выявила генетически обусловленной флуоресценции в этих нейронах. В другом случае генетическая маркировка сообщала об экспрессии белка ChAT (холин-ацетилтрансферазы), но антительная маркировка подтвердила это лишь в незначительной доле клеток. Эти результаты указывают на то, что генетическая маркировка может как занижать, так и завышать уровень экспрессии белка по сравнению с маркировкой антителами.
Таким образом, исследователи подчеркивают, что eFLASH и маркировка антителами в масштабе всего органа могут предоставить более богатый и полный контекст для данных, полученных генетическими методами. Открытие «значительной региональной потери PV-иммунореактивных нейронов у здоровых взрослых мышей и высокой индивидуальной изменчивости» подчеркивает важность целостного и непредвзятого фенотипирования, обеспечиваемого eFLASH. Как отметил Дэй Хи Юн, это «два разных инструмента для выполнения одной и той же работы», подчеркивая взаимодополняющий характер антительной и генетической маркировки. Соведущим автором исследования также является Ён-Гюн Пак, в настоящее время доцент KAIST в Южной Корее, ранее работавший постдоком в MIT.
