Сколько же тайн скрывается в хитросплетениях молекул, составляющих основу жизни? Ученые лишь начинают постигать невероятную сложность белков, этих универсальных рабочих клеток. Оказывается, что привычное представление о «белок = один ген» далеко от истины. Один-единственный ген способен порождать целое семейство белковых молекул, различающихся своей химической структурой – протеоформ. Эти разнообразные формы выполняют порой совершенно непохожие физиологические функции, играя ключевую роль в процессах, происходящих в живых организмах. И если учесть, что у человека насчитывается около 22 000 генов, то истинное количество протеоформ, формирующих сложнейший белковый ландшафт человеческого тела, остается пока загадкой.
На сегодняшний день главным инструментом в изучении протеоформ служит метод жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС). Этот высокочувствительный метод позволяет измерять биомолекулы с потрясающей точностью и является краеугольным камнем протеомного анализа. Однако традиционный подход к анализу протеоформ в ЖХ-МС сталкивается с ограничениями. Обычно белки предварительно расщепляют на мелкие фрагменты – пептиды. Более современный метод, известный как "top-down" протеомика, нацелен на анализ интактных, то есть целых, протеоформ при помощи ЖХ-МС. Тем не менее, создание всеобъемлющего атласа протеоформ человека, подобно амбициозному проекту «Геном человека», оказывается крайне сложной задачей, если полагаться только на возможности ЖХ-МС. Проблема заключается в чрезвычайной сложности биологических образцов, содержащих огромное количество разнообразных протеоформ. ЖХ-МС в одиночку просто не способен детектировать их все.
Революционный прорыв в этой области произошел в 2020 году благодаря группе Такемори из Университета Эхиме. Японские ученые разработали инновационный метод под названием PEPPI-MS, который кардинально улучшил фракционирование протеоформ, то есть их разделение на более простые составляющие перед анализом. PEPPI-MS – это метод высокоразрешающего фракционирования протеоформ, в основе которого лежит хорошо известная и недорогая система SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия). Использование PEPPI-MS для предварительного фракционирования образцов позволило значительно увеличить количество протеоформ, которые можно обнаружить с помощью последующего анализа ЖХ-МС. Высокая эффективность метода PEPPI привела к его быстрому распространению и признанию в качестве стандартного метода «предфракционирования» во многих исследованиях в области "top-down" протеомики.
Дальнейшим шагом в развитии методов анализа протеоформ стало сотрудничество группы Такемори с группой профессора Андреаса Толи из Университета Киля (Christian-Albrechts-Universität zu Kiel) в Германии. В 2022 году результатом совместных усилий стало создание ультрачувствительной системы для измерения протеоформ. Эта система представляет собой комбинацию фракционирования PEPPI-MS и масс-спектрометрии с ионной подвижностью FAIMS (высокопольная асимметричная ионная подвижность). FAIMS позволяет разделять протеоформы уже в газовой фазе, что существенно повышает разрешающую способность анализа.
Использование новой комбинированной системы открыло новые горизонты в протеомных исследованиях. В 2023 году ученым удалось провести детальный анализ протеоформ культивируемых клеток человека, применяя "top-down" протеомику. Более того, на основе полученных результатов была разработана новая методология, получившая название "middle-down" протеомика. Этот подход предполагает анализ продуктов переваривания протеоформ ферментом Glu-C, что позволяет получить более подробную информацию о структуре протеоформ.
Важным преимуществом PEPPI-MS является его доступность и простота внедрения. Для проведения фракционирования с использованием PEPPI-MS не требуется никакого специального дорогостоящего оборудования. Метод реализуется с использованием стандартного набора биохимического лабораторного оборудования. Именно легкость и доступность PEPPI-MS способствовали его быстрому распространению и превращению в стандартный метод фракционирования образцов в углубленной "top-down" протеомике.
Для того, чтобы сделать передовые разработки в области протеомного анализа доступными для широкого круга исследователей, группа Такемори разработала подробные экспериментальные протоколы для высокоразрешающего фракционирования протеоформ с использованием PEPPI-MS, а также для "top-down" и "middle-down" протеомики с применением FAIMS-ЖХ-МС. Результатом многолетней работы с 2020 по 2024 год стала публикация в авторитетном журнале Nature Protocols подробного и оптимизированного протокола, объединившего все последние достижения.
Ожидается, что публикация полного набора протоколов PEPPI-MS окажет значительное влияние на дальнейшее развитие исследований протеоформ и их практическое применение. Комплексные протоколы PEPPI-MS открывают возможности для высокоразрешающего фракционирования даже следовых количеств биологических образцов, что в свою очередь облегчает проведение масштабного анализа протеоформ с помощью ЖХ-МС. Это приближает нас к созданию полных атласов протеоформ для различных живых организмов и открывает новые перспективы для разработки методов диагностики заболеваний на основе точной информации о протеоформах.
Изображение носит иллюстративный характер
На сегодняшний день главным инструментом в изучении протеоформ служит метод жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС). Этот высокочувствительный метод позволяет измерять биомолекулы с потрясающей точностью и является краеугольным камнем протеомного анализа. Однако традиционный подход к анализу протеоформ в ЖХ-МС сталкивается с ограничениями. Обычно белки предварительно расщепляют на мелкие фрагменты – пептиды. Более современный метод, известный как "top-down" протеомика, нацелен на анализ интактных, то есть целых, протеоформ при помощи ЖХ-МС. Тем не менее, создание всеобъемлющего атласа протеоформ человека, подобно амбициозному проекту «Геном человека», оказывается крайне сложной задачей, если полагаться только на возможности ЖХ-МС. Проблема заключается в чрезвычайной сложности биологических образцов, содержащих огромное количество разнообразных протеоформ. ЖХ-МС в одиночку просто не способен детектировать их все.
Революционный прорыв в этой области произошел в 2020 году благодаря группе Такемори из Университета Эхиме. Японские ученые разработали инновационный метод под названием PEPPI-MS, который кардинально улучшил фракционирование протеоформ, то есть их разделение на более простые составляющие перед анализом. PEPPI-MS – это метод высокоразрешающего фракционирования протеоформ, в основе которого лежит хорошо известная и недорогая система SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия). Использование PEPPI-MS для предварительного фракционирования образцов позволило значительно увеличить количество протеоформ, которые можно обнаружить с помощью последующего анализа ЖХ-МС. Высокая эффективность метода PEPPI привела к его быстрому распространению и признанию в качестве стандартного метода «предфракционирования» во многих исследованиях в области "top-down" протеомики.
Дальнейшим шагом в развитии методов анализа протеоформ стало сотрудничество группы Такемори с группой профессора Андреаса Толи из Университета Киля (Christian-Albrechts-Universität zu Kiel) в Германии. В 2022 году результатом совместных усилий стало создание ультрачувствительной системы для измерения протеоформ. Эта система представляет собой комбинацию фракционирования PEPPI-MS и масс-спектрометрии с ионной подвижностью FAIMS (высокопольная асимметричная ионная подвижность). FAIMS позволяет разделять протеоформы уже в газовой фазе, что существенно повышает разрешающую способность анализа.
Использование новой комбинированной системы открыло новые горизонты в протеомных исследованиях. В 2023 году ученым удалось провести детальный анализ протеоформ культивируемых клеток человека, применяя "top-down" протеомику. Более того, на основе полученных результатов была разработана новая методология, получившая название "middle-down" протеомика. Этот подход предполагает анализ продуктов переваривания протеоформ ферментом Glu-C, что позволяет получить более подробную информацию о структуре протеоформ.
Важным преимуществом PEPPI-MS является его доступность и простота внедрения. Для проведения фракционирования с использованием PEPPI-MS не требуется никакого специального дорогостоящего оборудования. Метод реализуется с использованием стандартного набора биохимического лабораторного оборудования. Именно легкость и доступность PEPPI-MS способствовали его быстрому распространению и превращению в стандартный метод фракционирования образцов в углубленной "top-down" протеомике.
Для того, чтобы сделать передовые разработки в области протеомного анализа доступными для широкого круга исследователей, группа Такемори разработала подробные экспериментальные протоколы для высокоразрешающего фракционирования протеоформ с использованием PEPPI-MS, а также для "top-down" и "middle-down" протеомики с применением FAIMS-ЖХ-МС. Результатом многолетней работы с 2020 по 2024 год стала публикация в авторитетном журнале Nature Protocols подробного и оптимизированного протокола, объединившего все последние достижения.
Ожидается, что публикация полного набора протоколов PEPPI-MS окажет значительное влияние на дальнейшее развитие исследований протеоформ и их практическое применение. Комплексные протоколы PEPPI-MS открывают возможности для высокоразрешающего фракционирования даже следовых количеств биологических образцов, что в свою очередь облегчает проведение масштабного анализа протеоформ с помощью ЖХ-МС. Это приближает нас к созданию полных атласов протеоформ для различных живых организмов и открывает новые перспективы для разработки методов диагностики заболеваний на основе точной информации о протеоформах.
